四嗪二甲酰胺对白血病细胞株HL-60 体外作用的研究

中国临床药理学与治疗学 ›› 2006, Vol. 11 ›› Issue (9): 1006-1012.

四嗪二甲酰胺对白血病细胞株HL-60 体外作用的研究

周永列, 吕亚萍¹, 胡惟孝¹, 邱莲女, 王文松, 杨忠愚¹, 刘建栋

浙江省人民医院中心实验室, 杭州 310014, 浙江;
¹浙江工业大学药学院, 杭州 310014, 浙江

收稿日期:2006-04-21 修回日期:2006-08-10 出版日期:2006-09-26 发布日期:2020-11-05
通讯作者: 周永列, 男, 大学本科, 副主任技师, 副教授, 硕导, 研究方向:实验血液学。Tel:0571-85893266 　E-mail:labzyl@126.com
基金资助:
浙江省科技厅资助项目(No2003c33019)

Effects of N, N'-di-(m-methylphenyi)-3, 6-dimethyl-1, 4-dihydro-1, 2, 4, 5-tetrazine-1, 4-dicarboamide on HL-60 leukemia cells in vitro

ZHOU Yong-lie, LV Ya-ping¹, HU Wei-xiao¹, QIU Lian-Nu, WANG Wen-Song, YANG Zhong-yu¹, LIU Jian-dong

Central Laboratory , Zhejiang Provincial People's Hospital , Hangzhou 310014 , Zhejiang, China;
¹Colleage of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014 , Zhejiang , China

Received:2006-04-21 Revised:2006-08-10 Online:2006-09-26 Published:2020-11-05

摘要/Abstract

摘要： 目的观察四嗪二甲酰胺(ZGDHu-1) 体外抑制白血病细胞株HL-60 增殖, 诱导细胞分化和凋亡作用, 并对其作用机制进行初步探讨。方法将不同浓度的ZGDHu-1 与HL-60 细胞在体外培养, 台盼蓝染色、MTT 比色法观察对HL-60 细胞增殖的抑制作用;用细胞形态学、DNA 凝胶电泳、DNA 含量及细胞周期分析、Annexin-V/PI 双标记和DNA 片段原位末端标记法等分析细胞凋亡。通过NBT 试验、细胞表面抗原CD_11b 、CD₁₃ 、CD₁₄ 、CD₆₄ 和细胞形态学检测ZGDHu-1 对HL-60 细胞的分化作用。用Rh123/PI测定线粒体跨膜电位(ΔΧm) , 用流式细胞术检测Bcl-2 、Bax 、P53 、Fas 和线粒体膜蛋白的表达变化。结果 ZGDHu-1 呈现作用时间和剂量的量效性抑制HL-60 细胞增殖和活力, 10 ng·ml^-1 ZGDHu-1 作用HL-60 细胞24 ~ 72 h 后,MTT 法检测细胞增殖抑制率分别为(7.3 ±0.3) %、(15.8 ±1.0) %和(21.3 ±1.2) %, 均显著高于对照组(p<0.01);48 h 、72 h 的IC₅₀分别为180 、180 ng·ml^-1 。HL-60 细胞经ZGDHu-1 作用后, 大部分细胞阻滞于G_2-M 期, G_0/1期细胞减少;出现典型的细胞形态改变, DNA 片端化, 经50 ~1 000 ng·ml^-1的ZGDHu-1 作用后, SubG₁ 由(3.2 ±1.6) %上升至(67.7 ±5.9) %, 与对照组(0.7 ±0.5) %比较, 具有显著性差异(p<0.05) , Annexin-V/PI 标记升高, TUNEL 染色后的凋亡细胞的特征性改变等均证实ZGDHu-1 能诱导HL-60 细胞凋亡。HL-60 细胞经10 ~ 100 ng·ml^-1 ZGDHu-1 作用3 d后, 细胞发生部分分化,NBT 阳性率增加, 细胞表面CD_11b 、CD₁₃ 、CD₁₄ 、CD₆₄表达增加。ZGDHu-1 诱导HL-60 细胞凋亡和分化过程中, Bcl-2 表达无变化, 但Bax 表达显著增加, Bax/Bcl-2 的比值升高, Fas 表达增强, 而P53 表达无变化。随ZGDHu-1 作用的浓度增加, ΔΧm 下降、而线粒体膜蛋白表达显著升高。结论 ZGDHu-1 能抑制HL-60 细胞增殖和细胞活力,低浓度时诱导HL-60 细胞向粒单系分化, 高浓度时促进细胞凋亡, 其机制可能与Bax 表达上调, 线粒体膜电位下降等有关。

关键词: 四嗪二甲酰胺, 细胞株HL-60, 细胞凋亡, 细胞分化

Abstract: AIM: To study the effect of N, N'-di-(m-methylphenyi) -3, 6-dimethyl-1, 4-dihydro-1, 2, 4, 5-tetrazine-1, 4-dicarboamide (ZGDHu-1) on proliferation inhibition, differentiation and apoptosis in HL-60 human leukemia cell line and explore its possible mechanism.METHODS: Different concentration of ZGDHu-1 and the different time of cultivate were used to treat HL-60 cell.The proliferation inhibition was analyzed by cell counting,alive cell count and MTT assay.Cell apoptosis was analyzed by cell morphology, DNA agarose gel electrophoresis,DNA content and Annexin-V/PI.The TdT-mediated dUTpnick end labeling (TUNEL) assay was used to quantitate the in situ cell apoptosis.The cell morphological analysis, expression of CD_11b, CD₁₃, CD₁₄, CD₆₄ and NBT reduction were performed to evaluate differentiation of HL-60 cells.The expressions of bcl-2, bax, Fas, P53 and mitochondrial membrane protein were analyzed by flow cytometry.While the mitochondrial transmembrance potential (ΔΧm) was labeled by dihydrorhodamin 123.RESULTS: ZGDHu-1 could inhibit HL-60 cell proliferation viability within a certain range of treating time and doses, with a 48 h IC50 of 180 ng·ml^-1 and 72 h of 180 ng·ml^-1.A majority of HL-60 cells were arrested in G2/M phase and a progressive decline in G0/1.The HL-60 cells apoposis was confirmed by type cell morphology,DNA fragment, sub-G1 phase, TUNEL and Annexin-Ⅴ/PI Labeling method with a time and dose related manner.The morphology of HL-60 cells cultured in the presence of 10 -100 ng·ml^-1 ZGDHu-1 for three days was more mature with higher positive rate of NBT and up-regulated expressions of CD_11b, CD₁₃, CD₁₄ and CD₆₄ than those of control.The expression of bax and Fas was increased,and bcl-2 was unchanged by the treatment of ZGDHu-1.ZGDHu-1 could increase the expression of mitochondrial membrane protein in a dose-dependent manner while the ΔΧm was reduced.CONCLUSION: ZGDHu-1 can inhibit proliferation, induce differentiation and apoptosis of HL-60 cells.The mechanism may associate with its upregulation of bax, open the mitochondrial permeability transition pore and reduce ΔΧm.Furthermore, the Fas is activated during the apoptosis process.

Key words: N, N '-di-(m-methylphenyi)-3, 6-dimethyl-1, 4-dihydro-1, 2, 4, 5-tetrazine-1, 4-dicarboamide, Cell line HL-60, apoptosis, differentiation

中图分类号:

R965.2
R966

周永列, 吕亚萍, 胡惟孝, 邱莲女, 王文松, 杨忠愚, 刘建栋. 四嗪二甲酰胺对白血病细胞株HL-60 体外作用的研究[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2006, 11(9): 1006-1012.

ZHOU Yong-lie, LV Ya-ping<, HU Wei-xiao<, QIU Lian-Nu, WANG Wen-Song, YANG Zhong-yu<, LIU Jian-dong. Effects of N, N'-di-(m-methylphenyi)-3, 6-dimethyl-1, 4-dihydro-1, 2, 4, 5-tetrazine-1, 4-dicarboamide on HL-60 leukemia cells in vitro[J]. Chinese Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 2006, 11(9): 1006-1012.

参考文献

1 胡惟孝, 周茂, 蔡志彬, 杨忠愚.新型抗癌药3, 6-二甲基-1, 4-二氢-S-四嗪-1, 4-二甲酰胺类化合物及其制造方法[P].中国发明专利, 申请号ZL98121915.2, 证书号第159831 号
2 孙雅泉, 胡惟孝, 袁庆.N, N'-双间甲苯基-3, 6-二甲基-1, 4二氢-1, 2, 4, 5-四嗪-1, 4-二甲酰胺的合成和晶体结构[J].有机化学, 2003;23:483-7
3 蔡志彬, 周茂, 胡惟孝, 杨忠愚.N, N'-二取代苯基-3, 6-二甲基-1, 4 二氢-1, 2, 4, 5-四嗪-1, 4-二甲酰胺衍生物的合成及抗肿瘤活性[J].药学学报, 2000;35:793-6
4 周永列, 吕亚萍, 胡惟孝, 邱莲女, 王文松, 刘建栋.四嗪中国临床药理学与治疗学 2006 Sep;11(9) 二甲酰胺对白血病细胞株SHI-1 体外作用的研究[J].中华血液学杂志, 2006;27:361-5
5 周永列, 吕亚萍, 胡惟孝, 邱莲女, 王文松, 吴建国.四嗪二甲酰胺体外诱导NB4 细胞增殖、凋亡与分化作用的研究[J].中国实验血液学杂志, 2006;14:961-8
6 周永列, 吕亚萍, 邱莲女, 何国浓, 林惠君, 王文松.硝普钠抑制K562 细胞增殖并诱导细胞凋亡的实验研究[J].中国临床药理学与治疗学, 2004;9:1381-7
7 Koester SK, Roth P, Mikulka WR, Schlossman SF, Zhang CH,Bolton WE.Monitoring early cellular responses in apoptosis is aided by the mitochondrial membrane protein-specific monoclonal antibody APO2.7[J].Cytometry, 1997;29:306-12
8 Weixiao H, Guowu R, y aquan S.Synthesis and antitumor activity of S-tetrazine derivatives[J].Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, 2004;14:1177-81
9 Wedge SR, Newlands ES.O6-benzylguanine enhances the sensitivity of a glioma xenograft with low O6-alkyguanine-DNA alkyitransferase activity to temozolomide and BCNU[J].Br J Cancer,1996;73:1049-52
10 Kanzawa T, Germano IM, Kondo Y, Ito H, Kyo S, Kondo S.Inhibition of telomerase activity in malignant glioma cells correlation with their sensitivity to temozolomide[J].Br J Cancer,2003;89:922-9
11 HalestrapAp, Doran E, Gillespie JP, O'Toole A.Mitochondria and cell death.Biochemi Soci Transac, 2000;28:170-7
12 Shimizu S, Konishi A, Kodama T, Tsujimoto Y.BH4 domain of antoapoptotic Bcl-2 family members closes voltage-dependent anion channel and inhibits apoptotic mitochondrial changes and cell death[J].Proc Natl Acad Sci, 2000;97:3100-5
13 周永列, 吕亚萍, 胡惟孝, 邱莲女, 王文松, 杨忠愚, 等.四嗪二甲酰胺抑制肝癌细胞株HepG2 增殖并诱导细胞凋亡的研究[J].中国药理学通报, 2006;22:754-9

[1]	杨晓佳, 江萌, 吴敏, 张伊黎, 吕兰, 吴嫄芬, 王鑫昱, 刘立权. 藏红花素介导DKK3调控GSK-3β/β-catenin通路对阿尔兹海默症大鼠的认知改善作用[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2023, 28(5): 489-497.
[2]	王剑, 孙永东, 周兴玮, 刘雷, 陈龙, 童兴科, 朱佳丽. 黄芩素经由miR-125b-5p/IRF4轴进而促进喉癌细胞死亡并抑制其侵袭的机制研究[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2023, 28(11): 1209-1218.
[3]	华海燕, 严杰, 秦宇芬. 五味子乙素通过抑制心肌细胞凋亡减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的实验研究[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2022, 27(8): 848-856.
[4]	李雪恒, 李龙. 褪黑素与特发性肺纤维化关系的研究进展[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2022, 27(6): 715-720.
[5]	李莹, 姚伟, 王萌, 余志宏, 龚园其, 蓝海兵, 齐协飞. 鸢尾素通过NF-κB和JNK信号通路减轻屋尘螨诱导的气道上皮细胞炎症及凋亡的实验研究[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2022, 27(10): 1106-1112.
[6]	刘云帆, 杜月梅, 刘晓艺, 高丽萍. 枸杞多糖对顺铂诱导小鼠睾丸支持细胞凋亡的影响[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2021, 26(6): 624-630.
[7]	张伟萍, 江建军, 陈晓锋, 许莎莎. 栀子苷通过抑制VPO1/ERK1/2信号通路减轻糖尿病心肌病大鼠的心肌细胞凋亡[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2021, 26(2): 129-136.
[8]	沈芸, 张占丰, 王红灵, 赵冀安. 丹酚酸对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤的保护[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2020, 25(10): 1111-1118.
[9]	滕晓晶，董学妍，王智毅，余道军，王贤军. 扶正康复合剂联合顺铂抑制胃癌SGC7901细胞荷瘤裸鼠肿瘤增殖作用的实验研究[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2019, 24(7): 744-749.
[10]	孔令宇，席錾，杨亚勤，马文婷，吴畏，郝同琴. 地塞米松对小鼠急性胰腺炎胰腺组织中Notch信号及凋亡相关基因表达的影响[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2019, 24(2): 134-139.
[11]	齐冰丽，黄平，颜瑞雪，李倩. 柚皮素通过PI3K/AKT/NF-κB通路抑制卵巢癌细胞增殖和侵袭、诱导凋亡作用的研究[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2019, 24(11): 1234-1241.
[12]	曹迎亚，陈群，王箴，吴敬医，姜小敢，金孝岠，鲁卫华. 巨噬细胞在脂多糖诱导肠上皮细胞凋亡中的作用[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2019, 24(10): 1142-1146.
[13]	刘静，王媚媚，刘录山，贺卫和，庹勤慧，文红艳. 烟酸姜黄素酯对低剪切应力诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及相关机制[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2018, 23(8): 855-861.
[14]	李宏，陈菁，李丹，余文桃，刘正威，倪峰. 异嗪皮啶对人乳腺癌干细胞凋亡相关基因Bcl-2与Caspase家族表达的影响[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2018, 23(8): 886-892.
[15]	张新民，陈鹏，叶盛，夏武杰，李岳春. MG-132对CVB3病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡因子的作用研究[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2018, 23(5): 498-503.